耐热虾青素生产菌株的选育
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时间：2017-01-09
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虾青素（astaxanthin），是一种类胡萝卜素，因其具有优良的色素沉积作用、超强的抗氧化活性，以及抗癌、增强免疫、防止皮肤衰老等功能，被广泛应用于水产养殖、医药、化妆品等领域。法夫酵母因其合成的虾青素在总类胡萝卜素中所占比例高而受到重视。然而，法夫酵母的发酵温度为18-22℃，温度较低，工业生产中需要消耗大量的能量和成本来控制温度，尤其在气温较高的地区。所以构建一株能够耐热的虾青素生产菌株对于降低生产成本非常必要。 本文首先从发酵温度入手，利用原生质体融合技术构建出一株30℃生长的虾青素生产菌株；然后，以此耐热虾青素生产菌株为出发菌株，从发酵产量入手，利用基因组改组技术构建产量提高菌株，以达到降低能源消耗和发酵成本的目的。 （1）制备了法夫酵母、面包酵母、粘红酵母、毕赤酵母四种菌的原生质体，将法夫酵母分别与另外三种酵母进行原生质体融合，并在合适的条件下筛选目的菌株。结果显示，法夫酵母与面包酵母融合，得到了生长温度无明显提高的色素生产菌株；法夫酵母与粘红酵母融合，得到了30℃生长的色素生产菌株，但经HPLC检测无虾青素或者只有少量虾青素合成；法夫酵母与毕赤酵母融合，得到了30℃生长的色素生产菌株PP11，经HPLC检测确定其合成的主要色素为虾青素。与法夫酵母相比，PP11的生长温度有明显提高（约8℃），且合成虾青素，具备了本研究所期望的特性。 （2）对耐热虾青素生产菌株PP11的菌落特征、细胞形态进行了研究，结果显示，其菌落呈红色的规则圆形，边缘平滑，表面光滑、平整且湿润；细胞呈椭球形，和法夫酵母的形状相似，细胞体积接近两亲本细胞体积之和。 （3）对PP11的生长温度、菌体生长曲线和虾青素合成曲线进行了研究，结果显示，PP11的最适生长温度和最适虾青素合成温度均为30℃；当培养72h时，其虾青素产量达到最大，为5.99mg/L，此时的生物量和虾青素含量分别为21.9g/L和273μg/g。与法夫酵母相比，生物量提高76.5%，虾青素产量和含量分别降低47.08%和70%。 （4）用基因组改组的方法提高耐热菌株的虾青素产量。首先用紫外线和亚硝基胍对PP11进行诱变，然后以虾青素产量提高3.53-4.71%的突变菌株作为出发菌株，进行三轮基因组改组，用二苯胺和96孔板相结合的方法筛选，最终获得了两株虾青素产量明显提高的改组菌PPG3-115和PPG3-211，产量分别为7.29mg/L和7.32mg/L，比PP11提高了32.55%和33.09%。
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